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时间相关单光子计数荧光寿命测量中数据获取和处理

发布时间:

第 18 卷 第 2 期 1998 年 3 月

核电子学与探测技术 N uclear Electr onics & D etectio n T echno lo gy

Vo l. 18 N o. 2 M ar ch 1998

时间相关单光子计数荧光寿命 测量中数据获取和处理
龚达涛 刘天宽 虞孝麒 沈广德 施朝淑 邓杰 杨炳忻
( 中国科学技术大学*代物理系, 合肥, 230027)
  本文介绍了时间相关单光子计数荧 光寿命测量中的数据获取系统和数据分析方法。 关键词: 时间相关单光子计数 荧光寿命 最小二乘曲线拟合 多指数函数拟合

1 引言
时间相关单光子计数技术 是测量纳秒级荧光寿命的一种方法, 具有时间分辨好, 灵敏度 高等优点, 在物理学、 化学、 生物医学等领域有广泛的应用。 下面介绍我校物理系和*代物理系 合作建立的一套时间相关单光子计数荧光寿命测量系统中的数据获取系统和数据处理方法。
[ 1]

2 数据获取系统
使样品产生荧光的激发源可以是激光、 脉冲 放电光、 同步辐射光、 放射源等。图 1 是脉冲放电 光源作为激发源的荧光谱仪的系统组成框图。 激发光单色仪和荧光单色仪分别选取合适波 长的激发光和出射荧光。调节光通量使进入光电 倍增管的荧光为单光子。样品发射荧光经光电倍 增管、 快放大器、 恒比定时甄别器作为时幅变换器 ( T AC ) 的启动 信号( ST ART ) , 脉冲光源的光经 光电倍增管、 快放大器、 恒比定时甄别器、 延时器 作为 T AC 的停止信号( ST OP ) 。用荧光作 T AC 的启动信号可避免有激发光无荧光时 T AC 超时 引起的死时间。模数变换器( ADC ) 、 微机输入接 口卡和微计算机组成了计算机化的多道分析器, 用以测量样品的荧光衰变时间谱。微机输入接口卡还通过对两个恒比定时甄别器的输出信号 计数来测量激发光和荧光的计数率, 以监测样品的荧光激发效率。 其中微机输入接口卡是我们 自行研制的。 荧光谱仪的时间分辨主要由光电倍增管、 快脉冲放大器、 恒比定时甄别器、 AC、 T ADC 等 部件的时间晃动决定。测试表明, 在其他部件仔细选择的情况下, 该谱仪的时间分辨主要由光 电倍增管的时间晃动决定[ 2] 。 119
图 1 脉冲放电光源作为激 发源的 荧光谱仪的系统组成 框图

3 微机输入接口卡和在线数据采集程序
微机接口电路由一片 8255 和两片 8253 芯片 以及时序逻辑电路组成。ADC 数据通过 8255 芯 片获取, 8255 设为工作模式 1, 当 ADC 卡上 A/ D 变换完成时, 8255 自动将数据读入片上缓存, 向 计算 机发出中断请求信号。中 断处理子程序从 8255 中读入数据, 放入显示缓冲区, 在线数据采 集主程序从显示缓冲区取数据并实时显示。恒比 定时甄别器的信号用 8253 计数, 分别对应激发光 子和荧光光子计数( 见图 1) , 利用微机内部时钟, 采集软件每隔 1s 读取激发光光子和荧光光子计 数, 计算这段时间的计数比, 在屏幕上显示出来。 实时监测这个参 数对实验人员调试系统比较重 要。 在线数据采集软件在数据采集的同时, 还可 以实时进行 谱显示, 监测 出射荧光/ 激发光计数 图 2 数据采集主程序和中断处理 子程序流程图 比。 主程序用 Borl and C+ + 3. 1 编写, 中断处理子程序和数据接口初始化部分用汇编语言编写。 界面采用图形化界面, 操作简单方便。 由于实验测量时间往往较长, 采集软件允许用户设定定时间、 定谱峰高、 定激发光计数和 定谱总计数等 4 种自动终止方式。终止条件满足时采集软件将停止采集, 并将数据自动存盘, 因此可以实现无人看守自动工作。 在采集过程中允许用户进行逐道查看谱数据、 谱图放大缩小 等操作, 允许用户随时用键盘中断采集过程, 便于实验人员调试系统。图 2 是数据采集主程序 和中断处理子程序流程图。

4 离线数据分析
离线数据分析程序从所选激发光波长和荧光波长的时间谱数据出发, 分析各荧光成分的 强度和寿命。含有多种衰变成分的荧光时间谱假定为:
M

G( t ) = 其中 A k 为第 k 种成分的幅度,
k

∑A
k= 1

k

ex p( - t / k )

( 1)

为第 k 种成分的寿命, M 为成分数量。 ) ∫ P ( t′G( t - ∞ + ∞

考虑仪器响应函数 P ( t ) 和本底计数 B 的影响, 测量时间谱应为 Y( t) = B + t′ ) dt′ ( 2)

离线分析的任务是从实测曲线 I ( t ) 及仪器响应函数 P ( t) 分析各成分的强度 A k 和寿命
k

。 分析采用非线性最小二乘曲线拟合方法, 迭代过程用 M ar quardt 法 [ 3] 。拟合初值可由用户

输入, 也可对曲线粗略分析得到。如对两种衰变成分的衰变曲线, 先由曲线尾部段进行单指数 曲线拟合得到长寿命成分参数, 再由曲线前段进行双指数曲线拟合得到( 其中长寿命成分参数 已得到) 短寿命成分参数。 120

拟合过程中所用的目标函数为:
N 2
2

=


i= N 1

[ I ( t i ) - B - Y ( ti ) ] I ( ti )
2

2

( 3)

其中 N 1、 2 为拟合的起始道和终止道。拟合过程应使得 最小。 N 拟合效果采用两个方法检验: 第一个依据是拟合优度, 定义为
2 v

=

2 m in

/ ( N 2 - N 1 + 1- r)
2 v 2

( 3)

其中 r 为要分析的参数个数。 对于泊松分布的数据,
2 v

应接*于 1。 太小, 可能是数据量太小 ( 3)

的缘故。 太大, 可能是拟合曲线假设不合理。 第二个依据是残差 R ( ti ) = I ( ti ) - B - Y ( t i )

对于好的拟合, R( t i ) 应在 0 两侧随机分布; 如果假设曲线不合理, R ( ti ) 的分布往往呈某种规 律性。

5 实验结果
图 3 是用该谱仪测得的 BaF2 的 一个荧光寿命谱, 实验条件是: 激发 光 220nm , 荧 光 61. 1nm, 温 度 10K, 仪器函数假定为 函数。图 3a 纵轴 为计数值的对数, 横轴是时间, 每道 0. 08ns, 散点为实 验数据点, 实 线为 拟合曲线。图 3b 为归一化的残差分 布曲线。分析结果表明, 两种成分的 寿命分别为 0. 81、 9ns, 幅度分别 14. 为 60. 27 和 0. 016, 拟 合 优 度 为 1. 17。
参 考 文 献 1 2 3 邢蕴芳. 时间相关单光 子计数法及其生物学应用前景. 生物化学与生物物理 进展, 1987. ( 3) : 36. 沈广德. 一个时间分辨 谱仪的电子学系统的研制( 硕士论文) . 合肥: 中国科学技术大学. 1991. 26. 刘钦圣. 最小二乘问题 计算方法. 北京工业大学出版社. 1989. 90. ( 1997 年 1 月 7 日 收到) 图 3 BaF 2 的荧光寿命谱

Data A cquisition and Processing for T ime Correlated Single Photon Counting Fluorescence Lifet im e M easuring
ong Dat ao  L iu T iankuan Yu Xiaoqi Shen Guangde Shi Chao shu Deng Jie Yang Binx in
( Dept of M odern Phy sics, U ni o f Science and T echno lo g y of China, Hefei, 230027) Abstract T his paper int ro duces the data acquisitio n sy st em and off-line data pro cessing pr og ram fo r time co rr elated sing le photo n co unt ing fluor escence lifetime measur ing. ( Key Wo rds: T ime co rr elated sing le pho to n counting  Fluor escence lifetime L east squar e curv e fitting  M ulti- ponential curv e fitting ) ex 【 作者简介】 龚达涛, 男, 26 岁, 硕士, 博士生; 刘天宽, 男, 28 岁, 助教, 硕士; 虞孝麒, 男, 58 岁, 教 授; 沈广德, 男, 33 岁, 工程师, 硕士; 施朝淑, 女, 59 岁, 教授, 博导; 邓杰, 男, 29 岁, 讲 师, 博士; 杨炳忻, 男, 51 岁, 教授。

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